همسانه سازی و امکان سنجی انتقال ژن اینترفرون گاما به کلروپلاست توتون و بررسی گیاهان تراریخت

کشاورزی مولکولی شاخه جدیدی از بیوتکنولوژی گیاهی است که در آن گیاهان برای تولید پروتئین های نوترکیب دارویی و صنعتی در حجم زیاد مهندسی می شوند. یکی از تکنیک های مورد استفاده در کشاورزی مولکولی انتقال ژن به کلروپلاست به جای هسته در گیاهان می باشد که موجب شده است عملکرد و کیفیت پروتئین های تولید شده در گیاهان بهبود یابد و سیستم گیاهی را به یک سیستم تولید کم هزینه و کم خطر تبدیل نماید. استفاده از این تکنیک به دلیل مزایای زیاد احتمالا جوابگوی نیاز روز افزون به پروتئین های دارویی به ویژه در کشور های در حال توسعه خواهد بود. در این تحقیق، هدف امکان سنجی بیان ژن اینترفرون گامای انسانی در کلروپلاست گیاه توتون بود. اینترفرون گاما یکی از پروتئین های دارویی با ارزش در علم پزشکی است و در درمان سرطان ها و بیماری های عفونی کاربرد دارد. به منظور تولید این پروتئین در کلروپلاست، ژن اینترفرون گاما در ناقل کلروپلاستی pkcz ، بین پیشبرنده prrn و نشانگر گزینشی aada همسانه سازی شد. سپس برگهای توتون در شرایط استریل به وسیله ناقل حاوی اینترفرون گاما متصل به ذرات طلای 0/6 میکرونی با استفاده از سیستم بایولیستیک بمباران شدند. ریز نمونه های بمباران شده به محیط کشت rmop حاوی mg/l500 اسپکتینومایسین منتقل شدند. بعد از گذشت چند هفته گیاهچه های مقاوم به آنتی بیوتیک باززا شدند. این گیاهچه ها بعد از اینکه به حد کافی رشد کردند در محیط کشت ms حاوی اسپکتینومایسین ریشه دار شدند. گیاهان مقاوم در سطح dna، rna و پروتئین آنالیز شدند. نتایج آنالیزها در سطح dna نشان داد که ژن اینترفرون گاما در جایگاه صحیح در ژنوم کلروپلاست درج شده است سپس هموپلاسمی در گیاهان تراریخت کلروپلاستی با آزمون سادرن بلات تایید شد. رونویسی ژن اینترفرون گاما به وسیله تکنیک rt-pcr اثبات شد و بررسی بیان اینترفرون گاما به وسیله sds-page، آزمون دات بلات و وسترن بلات، تولید پروتئین اینترفرون گاما را در کلروپلاست نشان داد. نهایتا اندازه گیری میزان پروتئین اینترفرون گاما در برگ گیاهان تراریخت با آزمون elisa نشان داد که میزان بیان آن تقریبا 0/2% از کل پروتئین محلول در برگ می باشد که در مقایسه با تراریخت های هسته ای بسیار بالاتر می باشد اما به دلیل نیمه عمر پایین و تجزیه آن در کلروپلاست، میزان آن کمتر از تراریخت های کلروپلاستی می باشد.